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恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀及未來趨勢(shì)

更新時(shí)間:2025-06-23      點(diǎn)擊次數(shù):22

在這些恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中,以2000年shou次報(bào)道的LAMP法尤為耀眼和引人關(guān)注,目前占據(jù)超過60%的恒溫檢測(cè)市場(chǎng)。核酸檢測(cè)對(duì)LAMP技術(shù)如此親賴,究其原因,得益于其它恒溫檢測(cè)技術(shù)難以達(dá)到LAMP技術(shù)的綜合性優(yōu)勢(shì):

1、反應(yīng)速度極快,優(yōu)化的引物組合可以達(dá)到15min內(nèi)檢測(cè)到單copy分子,檢測(cè)速度接近或超過RPA和NASBA;

能夠達(dá)到超敏檢測(cè)極限,1-5copy的分子能夠穩(wěn)定檢出,穩(wěn)定性高,其它任何恒溫技術(shù)難以達(dá)到如此穩(wěn)定的水平;

2、結(jié)果判讀形式的多樣化,適應(yīng)各種環(huán)境和條件下的核酸快速檢測(cè)。LAMP擴(kuò)增作為終點(diǎn)判讀形式,可不借助任何其它輔助設(shè)備,裸眼觀察檢出結(jié)果?;阝}黃綠素、HNB、紅黃變色、OG橙綠變色都可以肉眼觀察結(jié)果。LAMP同樣可借助濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)濁度分析。在反應(yīng)體系中加入SYBR Green熒光染料后,可使用小型恒溫?zé)晒鈨x進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。以上這些結(jié)果判讀形式均可在野外等非標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,所需設(shè)備簡單、小巧、價(jià)格低廉、便于普及。除此外,傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中的熒光定量PCR儀,同樣可進(jìn)行LAMP檢測(cè),可采用SYBR Green、MB探針法或LAMP TaqMan探針法,對(duì)于經(jīng)常操作PCR檢測(cè)的人員來講,可以無縫對(duì)接、無需更換設(shè)備。

3、對(duì)RNA病毒的漏檢率低,由于RNA病毒的突變率較高,在PCR檢測(cè)中個(gè)別突變對(duì)PCR的擴(kuò)增影響較大,容易造成病毒漏檢的假陰性。而LAMP識(shí)別靶基因8個(gè)區(qū)段,在這些識(shí)別區(qū)段中個(gè)別的突變對(duì)LAMP擴(kuò)增影響較小,不易產(chǎn)生漏檢。

氧化酶.png

4、試劑穩(wěn)定、易于使用。同RPA、NASBA等技術(shù)相比,LAMP與PCR法都采用單一酶(或雙酶)系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng),生產(chǎn)批次穩(wěn)定、反應(yīng)酶系統(tǒng)耐高溫,試劑穩(wěn)定性好。在檢測(cè)試劑中僅包含酶mix一管、引物/探針一管,使用方便,在熒光定量PCR機(jī)器上可方便的進(jìn)行高通量檢測(cè)。而RPA、NASBA等系統(tǒng)需要多個(gè)復(fù)合酶,比例嚴(yán)謹(jǐn)、試劑穩(wěn)定生產(chǎn)困難、保存運(yùn)輸條件苛刻、難以高通量應(yīng)用。

5、LAMP法對(duì)耐受雜質(zhì)能力強(qiáng)。PCR、RPA、NASBA等擴(kuò)增體系均需要進(jìn)行核酸純化制備,在進(jìn)行粗制品的直擴(kuò)系統(tǒng)中,上樣量均較?。?lt;10%),無法大體積上樣,雜質(zhì)對(duì)這些擴(kuò)增方法均影響較大。而LAMP法對(duì)大多數(shù)樣本的耐受性能達(dá)到20%以上,個(gè)別樣本的含量可以容忍到50%以上,如此大的上樣體積量,決定了LAMP具有更高的檢出率。

6、擴(kuò)增反應(yīng)同步病毒滅活,由于LAMP反應(yīng)溫度在65℃的高溫條件下進(jìn)行,在病毒液直擴(kuò)中,反應(yīng)過程中即可滅活病毒,降低耗材的污染風(fēng)險(xiǎn)。

7、高特異性,隨著LAMP用酶不斷改進(jìn)、反應(yīng)緩沖液的不斷優(yōu)化、探針技術(shù)的搭配、引物設(shè)計(jì)理念的不斷改善,LAMP的非特異性擴(kuò)增獲得質(zhì)的提升,目前在優(yōu)化的LAMP體系中,假陽性的情況已經(jīng)得到改善,假陽性比例接近甚至低于PCR方法。

8、多重?zé)晒馓结樀膽?yīng)用。隨著Bst DNA聚合酶和反應(yīng)緩沖體系的不斷改進(jìn)、LAMP TaqMan技術(shù)的發(fā)明,多重LAMP體系得以建立。這種多重的LAMP技術(shù),達(dá)到了金標(biāo)準(zhǔn)TaqMan PCR的多靶基因、內(nèi)參質(zhì)控樣本的相同性能,符合到臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。

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恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

自1980年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明后,基于PCR技術(shù)的核酸檢測(cè)迅速應(yīng)用到臨床、食品、環(huán)境的檢測(cè)中,并成為核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但PCR的檢測(cè)技術(shù)存在設(shè)備體積大、粗樣品耐受性差、反應(yīng)時(shí)間長、靈敏度難以達(dá)到單copy等諸多缺點(diǎn),已經(jīng)難以滿足現(xiàn)代核酸檢測(cè)的要求:速度快(<30min)、超靈敏度(1-5copy/test)、大體積粗制樣品直檢(20-50%反應(yīng)體積樣本量)、野外操作、簡單化操作等方面的指標(biāo)。 在過去的20年中科學(xué)家一直嘗試通過恒溫?cái)U(kuò)增的方法來實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),這其中包括RCA(rolling circle amplification)、LAMP(loop-mediated isothermal amplification)、RPA(recombinase polymerase amplification)、NASBA(nucleic acid sequence based amplification)、SDA(strand displacement amplification)、HDA (helicase dependent amplification)、TMA(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。


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